近日，广州大学生命科学学院精准基因编辑工程中心王刚团队在Nature Communications发表了题为“Evolved cytidine and adenine base editors with high precision and minimized off-target activity by a continuous directed evolution system in mammalian cells（哺乳动物细胞持续定向进化出具有高精度和最小化脱靶活性的胞苷和腺嘌呤碱基编辑器）”的研究论文，成功研发了一套突破性的哺乳动物细胞持续定向进化系统（CDEM），为蛋白质进化包括基于CRISPR的碱基编辑器的进化提供了一种全新的方法。

近年来，CRISPR-Cas系统的强大应用价值不断被展现，其中碱基编辑器（Base Editor, BE）能够在不依赖DNA双链断裂情况下实现单个碱基的转换，因而具备实现精准基因编辑的能力，在基因治疗领域有着巨大的应用前景。然而，BE在多个方面仍有很大的提升空间，包括编辑准确性，脱靶率等。

BE在哺乳动物细胞持续定向进化的突破

     通过持续定向进化是提升BE编辑效率与精度的有效手段。早期的定向进化大多在原核生物中进行，虽然取得了诸多有效成果，但这些在单细胞系统中优化的编辑器，在复杂的哺乳动物细胞环境中常常失去效力或者活性下降。哺乳动物细胞与原核细胞或酵母细胞在蛋白质运输、加工及细胞器的复杂性有巨大差异，导致进化出的编辑器可能无法完全适应哺乳动物细胞的微环境，从而导致原核或者酵母进化的BE无法达到编辑效率最佳。此外，原核系统中噬菌体介导的进化方式存在基因携带上限的问题，使得BE必须以一分为二的形式进行进化，因而削弱了BE的整体效能。因此，哺乳动物细胞中亟需一个更为高效、连续的定向进化系统，以突破这一瓶颈。该文结合基于CRISPR的突变系统与抗生素瞬时转染，持续筛选，开发了CDEM这一系统。CDEM能够在哺乳动物细胞中实现全长度的BE进化，从而大大提升了定向进化的效果和成功率。此外，CDEM系统还有进化程序简单易控、突变聚集速度慢等优点。

CBE与ABE的进化新篇章

        该研究的核心在于通过CDEM系统，对现有的CBE（胞嘧啶碱基编辑器）和ABE（腺嘌呤碱基编辑器）进行持续进化，首先选择了CBE中的胞嘧啶脱氨酶以及ABEmax和ABE8e中的腺嘌呤脱氨酶进行持续定向进化。在哺乳动物细胞环境中，成功进化出的BE4变体不仅展现了更为狭窄的编辑窗口，同时保持了较高的编辑纯度，并且显著降低了非靶向效应。对于ABEmax和ABE8e，进化后的变体同样展示了编辑窗口的调整或缩窄，并且在非靶向效应上大幅下降。

       值得注意的是，该进化系统不仅解决了传统原核系统中由于蛋白质大小带来的限制问题，同时使用了全长的Cas9切口酶而非无酶活性的Cas9，避免了过去定向进化中需要分段处理的尴尬。通过CDEM，研究人员得以实现BE在哺乳动物细胞中连续进化的突破，为实现不同BE平台在哺乳动物细胞内的定向进化迈出了突破性的一步。

科学意义与未来展望

     此次研究不仅提升了CBE与ABE的编辑精准性，还为未来的基因治疗提供了极具潜力的工具。通过缩小编辑窗口，减少脱靶效应，有望在未来的临床应用中进一步降低脱靶编辑带来的副作用及提高治疗效果。这对那些依赖精准基因治疗的疾病，如遗传性疾病的治疗，具有不可忽视的意义。

     同时，CDEM在CBE和ABE的成功使其他基因/碱基编辑工具的快速、高效进化成为可能。随着CRISPR系统在医疗、农业等领域的广泛应用，如何进一步优化这些工具，提升它们在复杂生物系统中的适应性，成为了未来研究的热点。王刚团队的研究结果不仅提供了一种全新的持续定向进化思路，同时加速了基因编辑技术在临床上的应用。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52483-3#

该论文广州大学为第一通讯单位，赵娜博士和博士后周建为第一作者，王刚博士为论文的最后通讯作者，周建和广州医科大学高宗良教授为共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金的资助。

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Zhao, N. *;  Zhou, J. *^#;  Tao, T.;  Wang, Q.;  Tang, J.;  Li, D.;  Gou, S.;  Guan, Z.;  Olajide, J. S.;  Lin, J.;  Wang, S.;  Li, X.;  Zhou, J.;  Gao, Z. ^#; Wang, G. ^#, Evolved cytidine and adenine base editors with high precision and minimized off-target activity by a continuous directed evolution system in mammalian cells. Nature communications 2024, 15 (1).